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陽離子脂質(zhì)材料DOTMA、DOPE脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實驗步驟

更新時間:2021-05-25   點擊次數(shù):1348次
   脂質(zhì)體(LR)試劑是陽離子脂質(zhì)體DOTMA和DPE的混合物(1:1)。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中,是目前條件下最方面的轉(zhuǎn)染方法之轉(zhuǎn)染率高,優(yōu)于磷酸鈣法,比它高5-100倍,能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細胞。用LR進行轉(zhuǎn)染時,首先需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,應(yīng)找出該批LR對轉(zhuǎn)染某一特定細胞適合的用量、作用時間等,對每批LR都要做,先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間,DNA可從1-5ug和孵育時間6h,開始按這兩個參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線,再選用LR和DNA兩者最佳的劑量,確定出轉(zhuǎn)染時間,因LR對細胞有一定的毒性,轉(zhuǎn)染時間以不超過24h為宜。
  細胞種類:C0-7、BHK、NIH-3T3、Hela和 Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。
  一、操作步驟:
  取6孔培養(yǎng)板,向每孔中加入2m1含(1-2)x105個細胞的培養(yǎng)基,37℃、18%C02培養(yǎng)基40%-60%匯合時。
  2)轉(zhuǎn)染液制備:在聚苯y(tǒng)i烯管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染1個空細胞所用的A液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋DNA使?jié)舛葹?-10ug,終量100u1。B液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋LR,使終濃度為2-50ug,終量100u1輕輕混合A液、B液,室溫中置10-15min,稍后會岀現(xiàn)微濁現(xiàn)象,但并不妨礙轉(zhuǎn)染
  3)轉(zhuǎn)染準備:用2m1不含血清培養(yǎng)基漂洗2次,再加入1m1不含血清培養(yǎng)基
  4)轉(zhuǎn)染:把AB復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)基中,搖勻,置37℃溫箱中6-24h吸除無血清轉(zhuǎn)染液,換入正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)
  5)其余處理:如觀察、篩選、檢測等與其他轉(zhuǎn)染法相同
  6)注意:轉(zhuǎn)染時切勿加血清,血清對轉(zhuǎn)染效率有很大影響。
  二、脂質(zhì)體快速轉(zhuǎn)染法的操作步驟
  1)將5 105個細胞/孔接種到6孔板中培養(yǎng)24h,使細胞達到50%-60%的板底面積。
  2)在試管中制備DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物
  1.1)在1m1無血清DMEM中稀釋PSV1-新質(zhì)粒DNA或供體DNA
  1.2)旋轉(zhuǎn)1s,然后加入脂質(zhì)體混懸液,旋轉(zhuǎn)。
  1.3)室溫放置5-10分鐘,使DNA與脂質(zhì)體結(jié)合。
  3.棄去細胞內(nèi)的舊液,用1m1無血清DMEM洗滌細胞一次,然后棄去細胞,直接向每個孔中加入1 m1脫氧核糖核酸-脂質(zhì)體復(fù)合物,在37培養(yǎng)3-5天,然后向每個孔中加入含20%胎牛血清的DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)14-24小時。吸出脫氧核糖核酸脂質(zhì)體混合物,加入含10%胎牛血清的新鮮DMEM,2m1/l,培養(yǎng)24-48h。通過細胞刮取或消化收集細胞用于分析和鑒定.
  三、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法:
  1)接種的細胞與上述相同,細胞生長到50%
  2)DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染細胞的制備同上。
  3)向每個孔中加入1m1含20%胎牛血清的DMEM,在37培養(yǎng)48h。
  4)吸出DEM,用G418選擇性培養(yǎng)基稀釋細胞,讓細胞生長一定時間,篩選轉(zhuǎn)染克隆。該方法按照細胞克隆篩選方法進行。
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